[摘要]目的：分离培养脂肪干细胞(adipose-derived Stem cells，ADSCs)，探讨其培养上清液对成纤维细胞的生物学作用。方法：从人腹部脂肪组织中分离、培养ADSCs，收集其上清液培养人成纤维细胞。MTT法测定成纤维细胞的增殖；AnexillV／PI双染色法测定成纤维细胞的凋亡：体外细胞划痕法测定其迁移能力。结果：培养获得ADSCs，ADSCs培养上清液实验组成纤维细胞的增殖及迁移均明显大于对照组(P<0．05或P<0．01)：同时其凋亡率也低于对照组(P<0．05)。结论：ADSCs培养上清液能促进成纤维细胞的增殖、迁移及抑制凋亡发生。
[关键词]脂肪干细胞：成纤维细胞：增殖；迁移；凋亡
Effect of the conditioned medium of ADSCs on fibroblasts
Abstract：Objective To isolate and culture adipose-derived stem cells (ADSCs)，and study the effect of the conditioned medium 0f ADSCs(ADSC-CM)on fibroblasts．Methods ADSCs was isolated from human adipose tissue and cultured Then the conditioned medium of ADSCs was used to culture fibroblasts．Cells counting by the MTT method was to determined the proliferation，Annexin V／PI was used to investigate the apoptosis rate of fibroblasts；the cell migration was measured by in intro wound-healing assay．Results ADSCs was derived by culture Compared with those in control group，the proliferation and migration in ADSC—CM group were significantly higher than that in control group(P<0 05 or P<0．01)：and the apoptosis rate of fibroblasts in ADSC-CM group was also found to lower than that in control group(P<0．05)．Conclusion ADSC-CM could obviously promote fibroblasts on proliferation；migration and suppress apoptosis
Key words：adipose-derived stem cells；fibroblast；proliferation；migration；apoptosis
近年来，随着组织工程及再生医学的迅猛发展脂肪干 细胞(adipose—derived stem cellS，ADSCs)鉴于其取卡材方 便，来源丰富，低免疫及多分化潜能等诸多点，已成为 人们研究的热点。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潜 能在组织工程和再生医学中的应用，很少关注ADSCs分泌 功能在组织损伤修复中的作用。本实验观察研究了ADSCs分泌功能对成纤维细胞的生物学影响，探讨ADSCs分泌功能促创面愈合的机制。
1材料和方法
1．1主要仪器与试剂：DMEM培养液、胰酶、I型胶原酶、二甲基亚砜、MTT、小牛血清(美国GIBCO公司)，胎牛血清(上海四季青生物工程有限公司)，annexin V凋亡检测试剂盒(深圳晶美公司)，Mondel 680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)，YJ一875型超净工作台(苏州净化设备厂)，CO2细胞培养箱(美国科学仪器公司)，倒置显微镜(日本0LYMPIJS公司)，流式细胞仪(美国EOICS公司)。
1．2 ADSCs分离与培养：取腹部外科手术 患者皮下脂肪组织约59(获病人同意)，无菌条件下用剪刀剔除血管及其它组织碎片，用含双抗的PBS液反复浸泡冲洗3次，每次约5min，用眼科剪将脂肪组织剪成约lmm3的碎块，置于0．1％的I型胶原酶中于37℃水浴振荡消化1h；加入等体积l0％胎牛血清终止消化后，用200目的细胞筛网过滤，600g离心lOmin，弃去上层脂肪及上清液，沉淀用含l0%胎牛血清培养液重悬接种于培养瓶，置于37℃、5％的C02培养箱中常规培养。2天后换液，细胞长满80％时传代培养。
1．3 ADSCs培养上清液的制备：选择生长良好第3代．ADSCs细胞接种于75cm2的培养瓶，生长至80％融合时，换成尢血清培养液DMEM15ml，培养3天后，收集上清液(ADSC-CM)。上清液经O．22μm的滤膜过滤．分装，一80。C冻存备用。
1．4人皮肤成纤维细胞的培养：用组织块法培养原代细胞，置于10％小牛血清培养液中，置于37℃、5％C02培养箱中常规培养。
1．5成纤维细胞增殖的测定：采用MTT法测定。传代时取第3代成纤维细胞以3×10／孔接种于12孔板，常规培养24h后弃上清，设实验组(分别为10％ADSC-CM组、30％ADSC-CM组、50％ADSC-CM组)及对照组，实验组均用ADSC-CM及2％小牛血清配制，对照组仅用2％小牛血清培养液，每组设3个复孔。各组加对应的培养液lml，继续培养3天后，每孔分别加入5g／L的MTT 100μl，37℃、5％C02孵育4h后，终止培养：吸弃上清液，每孔加入750μl。二甲基亚枫，继续孵育lOmin后轻微振荡使紫蓝色沉淀溶解，然后以150μl／孔转移至96孔板，每孔重复5次。用酶标仪测定490nm波长下的吸光度(OD)值。